译：烨古 (独侵红尘，启世华章；智者利器，烨古铸造…)
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一个类SARS蝙蝠冠状病毒群显示人类感染的可能性
维内特·德梅纳赫里，小博伊德·L·尤恩特，卡丽·德宾克，苏达卡·阿格尼霍特拉姆，丽莎·E·格拉林斯基，杰西卡·A·普兰特，瑞秋·L·格雷厄姆，特雷弗·斯科比，邢易戈，埃里克·F·唐纳森，斯科特·H·兰德尔，安东尼奥·兰扎维奇亚，韦恩·A·马拉斯科，正丽·石&拉尔夫·S·巴里克
《自然医学》第21卷第1508-1513页（2015年）
原始论文链接：https://www.nature.com/articles/nm.3985%3Ffbcldi%3DlwAROiTTfDIT-uxNFPtvQH-xFrF6QaF1hKE1Ey2TPrEi17XfFUIbpUIAosDc
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS- CoV冠状病毒）和中东呼吸综合征（MERS-冠状病毒）的出现突出了跨物种传播事件导致人类爆发的威胁。在这里，我们研究了一种SARS样病毒SHC014-冠状病毒的潜在致病性，这种病毒目前在中国马蹄蝠种群中传播①。利用SARS-冠状病毒反向遗传系统②，我们在小鼠适应SARS-冠状病毒的脊骨中产生并鉴定了一种表达蝙蝠冠状病毒SHC014峰的嵌合病毒。结果表明，在野生型主干中编码SHC014峰的2b组病毒能有效地利用SARS受体人血管紧张素转换酶II（ACE2）的多个同源基因，在原代人气管细胞中高效复制，并在体外获得与SARS-冠状病毒流行株相当的效价。此外，体内实验显示嵌合病毒在小鼠肺中的复制具有显著的发病机制。对现有的基于SARS的免疫治疗和预防方法的评估显示效果不佳；单克隆抗体和疫苗方法均未能中和与保护使用新的棘突蛋白的冠状病毒感染。在此基础上，我们合成了一株具有感染性的全长SHC014重组病毒，并证明了该病毒在体内外的复制能力。我们的研究表明，目前在蝙蝠种群中传播的病毒有可能再次出现SARS-冠状病毒。
正文
SARS- CoV冠状病毒的出现预示着全球范围内严重呼吸系统疾病的跨物种传播进入了一个新的时代，并在全球范围内迅速蔓延，产生了巨大的经济影响。从那时起，动物种群中出现了包括甲型流感病毒株H5N1、H1N1和H7N9以及MERS-冠状病毒在内的几种病毒株，给疫区造成了相当大的疾病、死亡率和经济困难⑤。尽管公共卫生措施能够阻止SARS-冠状病毒的爆发④，但最近的亚基因组学研究已经确定了在中国蝙蝠种群中传播的与SARS密切相关的病毒序列，这些病毒可能构成未来的威胁。然而，序列数据本身提供了识别和准备未来的盘前病毒的最小洞察力。因此，为了研究传播蝙蝠冠状病毒的出现可能性（即感染人类的可能性），我们从中国马蹄蝠①分离的RsSHC014-冠状序列中构建了一种编码人畜共患冠状病毒棘突蛋白的嵌合病毒，其背景是SARS冠状病毒小鼠适应的脊骨。这种杂交病毒使我们能够评估这种新的棘突蛋白引起疾病的能力，而不必依赖于其自然基础上其他必要的适应性突变。利用这一方法，我们在原代人体气管细胞和体内鉴定了SHC014棘突蛋白介入导致的冠状病毒感染，并测试了现有免疫疗法对SHC014-冠状病毒的疗效。综合起来，该策略转译成宏基因组学数据，以帮助预测和准备未来的紧急病毒。
SHC014和相关RsWIV1冠状病毒的序列显示，这些冠状病毒是与流行性SARS冠状病毒株最接近的亲缘病毒（图1a，b）；然而，与SARS冠状病毒受体人ACE2结合的14个残基存在重要差异，包括对宿主范围至关重要的5个残基：Y442、L472、N479、T487和Y491（参考文献7）。在WIV1中，其中三种残基与流行性SARS-冠状病毒-Urbani株不同，但预计它们不会改变与ACE2的结合（补充图1a、b和补充表1）。这一事实得到了两个假分型实验的证实，即测量编码WIV1棘突蛋白的慢病毒进入表达人ACE2的细胞的能力（补充图1）和WIV1-冠状病毒的体外复制分析（参考文献1）。相比之下，SHC014中14个ACE2相互作用残基中有7个不同于SARS冠状病毒，包括对宿主范围至关重要的所有5个残基（补充图1c和补充表1）。这些变化，加上表达SHC014棘突的假型慢病毒未能进入细胞（补充图1d），表明SHC014峰不能结合人类ACE2。然而，在相关的SARS-冠状病毒株中也有类似的变化，以允许ACE2结合7,8，这表明需要额外的功能测试来验证。因此，我们在确保有复制能力的情况下，以小鼠适应SARS冠状病毒为主干合成了SHC014棘突（以下我们将嵌合冠状病毒作为SHC014-MA15），以最大限度地发挥小鼠发病机制和疫苗研究的机会（附图2A）。尽管基于结构的建模和假分型实验都有预测，但SHC014-MA15是可行的，并在Vero细胞中复制到高滴度（补充图2b）。与SARS类似，SHC014-MA15也需要一个功能性ACE2分子进入，可以使用人、麝香猫和蝙蝠ACE2同源物（补充图2c、d）。为了测试SHC014峰介导人气管感染的能力，我们检测了人上皮性气管细胞系Calu-32B4（参考文献9）对感染的敏感性，发现SHC014-MA15复制能力强，与SARS 冠状病毒 Urbani相似（图1c）。为了扩展这些发现，原代人气管上皮（HAE）培养物被感染并显示出两种病毒的强大复制（图1d）。总之，这些数据证实了SHC014尖峰病毒感染人类气管细胞的能力，并强调了SHC014冠状病毒跨物种传播的潜在威胁。
图1:SARS样病毒在人气管细胞中复制并产生体内发病机制。
图1
（a） 代表性冠状病毒的全长基因组序列按照在线方法进行了排列和系统发育图谱绘制。比例尺代表核苷酸替换，只有超过70%的引导支持被标记。树状图显示冠状病毒可分为三个不同的系统发育类群，分别为α-CoVs、β-CoVs和γ-CoVs。经典的亚群簇被标记为2a、2b、2c和2d（β-CoVs）和1a和1b（α-CoVs）。（b） 对包括SARS-CoV在内的2b组具有代表性的β-CoV的S1区序列进行了序列比对和系统发育定位。刻度条代表氨基酸替代。（c，d）两种细胞感染Calu-32b4细胞（c）或分化良好的一级气液界面HAE细胞培养物（d）后，SARS-冠状病毒-Urbani（黑色）和SHC014-MA15（绿色）的病毒复制，感染倍数（MOI）均为0.01。用生物复制物（n=3）在个别时间点收集Calu-3和HAE实验的样本。（e，f）10周龄BALB/c小鼠经鼻（i.n.）途径感染1×104 p.f.u.小鼠适应的SARS-冠状病毒 MA15（黑色）或SHC014-MA15（绿色），体重减轻（n=9，SHC014-MA15（e）；n=16，肺部病毒复制（n=3，SARS-冠状病毒 MA15；n=4，SHC014-MA15）。（g，h）显示了感染SARS-冠状病毒-MA15（N=3只小鼠）（g）或SHC014-MA15（N=4只小鼠）（h）的小鼠肺切片的代表性图像。对于每个图形，中心值表示组平均值，误差条定义s.e.m.比例尺，1 m m。
为了评估SHC014峰在体内介导感染中的作用，我们用104个SARS-MA15或SHC014-MA15的斑块形成单位（p.f.u.）感染10周龄BALB/c小鼠（图1e-h）。感染SARS-MA15的动物在感染后4d（d.p.i.）体重迅速下降并致死；相比之下，感染SHC014-MA15的小鼠体重显著下降（10%），但没有致死性（图1e）。病毒复制检查显示，感染SARS-MA15或SHC014-MA15的小鼠肺部的病毒滴度几乎相等（图1f）。SARS-MA15感染小鼠的肺在终末细支气管和肺实质2 d.p.i（图1g）中均显示强染色，而SHC014-MA15感染小鼠的肺则显示气管抗原染色减少（图1h）；相反，在肺实质或整个组织学评分中未观察到抗原染色缺陷，提示SHC014-MA15肺组织的差异性感染（补充表2）。我们接下来分析了更易感的、年龄较大（12个月大）的动物的感染情况。SARS-MA15–感染动物迅速减肥并死于感染（补充图3a、b）。SHC014-MA15感染可诱导健康和持续的体重下降，但致死率最低。我们在幼鼠中观察到的组织学和抗原染色模式的趋势在老年动物中保持不变（补充表3）。我们排除了SHC014-MA15通过替代受体介导感染的可能性，这是基于使用Ace2-/-小鼠进行的实验，在SHC014-MA15感染后没有显示体重减轻或抗原染色（补充图4a、b和补充表2）。总之，这些数据表明，具有SHC014尖峰的病毒能够在小鼠体内诱导毒性冠状病毒主干的情况下减轻体重。
鉴于埃博拉单克隆抗体疗法（如ZMApp10）的临床前疗效，我们接下来试图确定SARS-冠状病毒单克隆抗体对SHC014-MA15感染的疗效。四种广谱中和的抗SARS冠状病毒尖峰蛋白单克隆抗体已被报道，是可能的免疫治疗试剂11，12，13。我们检测了这些抗体对病毒复制的影响（表示为病毒复制的抑制百分比），发现虽然野生型SARS-冠状病毒-Urbani在相对较低的抗体浓度下被所有四种抗体强烈中和（图2a-d），但SHC014-MA15的中和作用不同。由噬菌体展示和逃逸突变体11，12产生的抗体Fm6，仅达到抑制SHC014-MA15复制的背景水平（图2a）。同样，从SARS-冠状病毒感染患者13的记忆B细胞中获得的抗体230.15和227.14也未能阻断SHC014-MA15的复制（图2b、c）。对于这三种抗体，SARS和SHC014尖峰氨基酸序列之间的差异对应于SARS-冠状病毒逃逸突变体（fm6-N479R；230.15-L443V；227.14-K390Q/E）中直接或相邻的残基变化，这可能解释了抗体对shc2014的中和活性的缺失。最后，单克隆抗体109.8能够实现SHC014-MA15的50%中和，但仅在高浓度（10μg/ml）下（图2d）。总之，研究结果表明，抗SARS-冠状病毒的广泛中和抗体可能对诸如SHC014这样的SARS样冠状病毒紧急菌株只有微弱的疗效。
图2:SARS-冠状病毒单克隆抗体对类SARS-冠状病毒的作用不大。
图2
（a–d）中和试验评估一组单克隆抗体的疗效（以减少斑块数量衡量），这些单克隆抗体最初都是针对流行性SARS-冠状病毒产生的，对Vero细胞感染SARS-冠状病毒-Urbani（黑色）或SHC014-MA15（绿色）的效果。检测的抗体为fm6（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=5）、11、12（a）、230.15（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=2）（b）、227.15（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=5）（c）和109.8（Urbani的n=3；SHC014-MA15的n=2）13（d）。每个数据点代表定义s.e.m.的组平均值和误差条。注意，b、c中受SARS-冠状病毒-Urbani感染的Vero细胞中的误差条被符号重叠，不可见。
为了评价现有疫苗对SHC014-MA15感染的效力，我们用双灭活的SARS冠状病毒（DIV）接种老龄小鼠。先前的研究表明，DIV可以中和和保护幼鼠免受同源病毒14的攻击；然而，该疫苗未能保护老龄动物，在老龄动物中还观察到增强的免疫病理学，这表明动物可能因接种而受到伤害15。在这里，我们发现DIV并不能保护SHC014-MA15免受与体重减轻或病毒滴度有关的挑战（补充图5a，b）。与之前关于其他异种组2b-冠状病毒s15的报告一致，来自已接种DIV的老龄小鼠血清也未能中和SHC014-MA15（补充图5c）。值得注意的是，DIV疫苗接种导致强大的免疫病理学（补充表4）和嗜酸性粒细胞增多症（补充图5d-f）。总之，这些结果证实DIV疫苗对SHC014的感染没有保护作用，并且可能增加老年接种组的疾病。
与DIV疫苗相比，SHC014-MA15作为减毒活疫苗对SARS冠状病毒的攻击具有潜在的交叉保护作用，但其结果有重要的注意事项。我们用104p.f.u.的SHC014-MA15感染幼鼠并观察28天。然后在第29天用SARS-MA15攻击小鼠（补充图6a）。使用高剂量SHC014-MA15的小鼠先前的感染可保护其免受致命剂量的SARS-MA15的攻击，尽管在SHC014-MA15感染后28天，从所诱发的抗血清中只有最小的SARS-冠状病毒中和反应（补充图6b，1:200）。在没有二级抗原增强的情况下，28 d.p.i.代表预期的抗体滴度峰值，并暗示随着时间的推移，对SARS-冠状病毒的保护作用将减弱16,17。在老年BALB/c小鼠身上观察到了类似的结果，表明用致死剂量的SARS-冠状病毒可以防止体重减轻和病毒复制（补充图6c，d）。然而，104 p.f.u.的SHC014-MA15感染剂量诱导一些老年动物的体重减轻和致死率大于10%（图1和补充图3）。我们发现，用较低剂量的SHC014-MA15（100p.f.u.）接种疫苗不会导致体重下降，但也不能保护老年动物免受SARS-MA15致死剂量挑战（补充图6e，f）。总之，这些数据表明，SHC014-MA15的挑战可能通过保守的表位提供对SARS冠状病毒的交叉保护，但所需的剂量会诱发发病并阻止作为减毒疫苗使用。
在确定SHC014尖峰具有介导人类细胞感染和在小鼠中引起疾病的能力之后，我们接下来基于用于SARS-冠状病毒的方法合成了全长SHC014-冠状病毒感染克隆（图3a）2。与SARS-冠状病毒相比，SHC014-冠状病毒在Vero细胞中的复制没有缺陷（图3b）；然而，SHC014-冠状病毒在感染后24和48小时在原代培养的HAE中明显减弱（P<0.01）（图3c）。与SARS-冠状病毒-Urbani相比，小鼠体内感染SHC014-冠状病毒后体重没有明显下降，但肺部病毒复制减少（图3d，e）。这些结果共同证实了全长SHC014-冠状病毒的生存能力，但提示其在人类呼吸细胞和小鼠中的复制与SARS-冠状病毒相当需要进一步的适应。
图3：全长SHC014冠状病毒在人体呼吸道复制，但缺乏传染性非典型肺炎冠状病毒的毒力。
图3
（a） SHC014 冠状病毒分子克隆的示意图，其合成为六个相邻的cDNA（指定为SHC014A、SHC014B、SHC014C、SHC014D、SHC014E和SHC014F），其两侧有独特的BglI位点，可定向组装表达开放阅读框（1a、1b、spike、3、envelope、matrix、6–8和核衣壳）的全长cDNA。带下划线的核苷酸代表限制性内切酶裂解后形成的悬垂序列。（b，c）Vero细胞感染后SARS-冠状病毒-Urbani（黑色）或SHC014-冠状病毒（绿色）的病毒复制（b）或分化良好的一级气液界面HAE细胞培养（c），MOI为0.01。在各时间点采集样本，每组进行生物复制（n=3）。数据代表了Vero和HAE细胞的一个实验。（d，e）通过i.n.途径感染1×105 p.f.u.的SARS-冠状病毒 MA15（灰色）、SHC014-冠状病毒（绿色）或SARS-冠状病毒 Urbani（黑色）的10周龄BALB/c小鼠的体重减轻（n=3，SHC014-冠状病毒；n=6，SARS-Urbani）（d）和肺部病毒复制（n=3，SARS-Urbani和SHC014-冠状病毒）（e）。每个数据点代表组的平均值，误差条定义了s.e.m.*P<0.01和***P<0.001，使用学生对单个时间点的双尾t检验。
在SARS-冠状病毒流行期间，棕榈麝香猫和人类4中检测到的冠状病毒株之间很快建立了联系。在这一发现的基础上，普遍出现的范式认为，传染性非典型肺炎冠状病毒起源于蝙蝠病毒，跳转到麝猫身上，并在受体结合域（RBD）内加入变化，以改善与麝猫Ace2的结合（参考文献18）。随后暴露在活的动物市场中的人允许人感染麝香猫株，而麝香猫株又适应成为流行株（图4a）。然而，系统发育分析表明，早期人类SARS病毒株与蝙蝠病毒株的亲缘关系比与麝香猫病毒株18的亲缘关系更为密切。因此，第二种模式认为，蝙蝠与人的直接传播引发了SARS-冠状病毒的出现，而棕榈麝香猫是继续感染的第二宿主和宿主（图4b）19。对于这两种模式，第二宿主的棘突适应被认为是必要的，大多数突变预计发生在红细胞内，从而促进改善感染。这两种理论都暗示蝙蝠冠状病毒库是有限的，宿主范围的突变是随机的和罕见的，降低了人类未来出现事件的可能性。
图4：冠状病毒的出现模式。
图4
冠状病毒株维持在蝙蝠种群中循环的准种池中。（a，b）传统的SARS-冠状病毒发生理论认为，宿主范围的突变（红圈）代表了随机和罕见的情况，允许替代宿主的感染。第二宿主模式（a）认为，非人类宿主被蝙蝠前体病毒感染，通过适应，有助于传播给人类；随后在人类中的复制导致流行性病毒株。直接模式（b）表明，蝙蝠和人类之间的传播不需要中间宿主的要求；然后在人类种群中进行选择，与之密切相关的病毒在第二宿主中复制，从而允许病毒在两者中持续存在和适应。（c）来自类似SARS的嵌合体病毒的数据表明，准物种库保持了多种病毒能够在不需要突变的情况下感染人类细胞（红圈）。尽管流行病的发生可能需要在二级宿主或人类宿主中进行适应，但如果SHC014含穗病毒与毒性冠状病毒骨干（绿色轮廓的圆圈）重组，那么流行病可能是人类的结果。现有数据支持所有三种范式的元素。
尽管我们的研究并没有使其他的出现途径失效，但它确实支持第三种模式，即循环的蝙蝠-冠状病毒池保持“稳定”的棘突蛋白，这种蛋白能够在没有突变或适应的情况下感染人类（图4c）。这一假设通过一种在SARS冠状病毒主干中含有SHC014峰的嵌合病毒在人类气管培养物和没有RBD适应的小鼠中引起强烈感染的能力得到了证实。再加上对先前发现的致病性冠状病毒背板3,20的观察，我们的结果表明，SARS样紧急菌株所需的起始物质目前正在动物体内循环。值得注意的是，尽管全长SHC014-冠状病毒可能需要额外的主干适应来介导人类疾病，但冠状病毒家族中记录的高频重组事件强调了未来出现的可能性和进一步准备的必要性。
迄今为止，动物种群的基因组学筛选主要用于在暴发设置21中识别新病毒。这里的方法扩展了这些数据集，以检查病毒出现和治疗效果的问题。我们认为带有SHC014的病毒具有潜在的威胁，因为它们能够在人类原代呼吸道培养物中复制，这是人类疾病的最佳模型。此外，在小鼠中观察到的发病机制表明，含有SHC014的病毒有能力在哺乳动物模型中引起疾病，而无RBD适应。值得注意的是，与SARS-MA15相比，HAE培养物中全长SHC014冠状病毒在肺中的向异性和相对于SARS-冠状病毒 Urbani的衰减表明，除ACE2结合外，包括棘突加工性、受体生物有效性或宿主免疫反应的拮抗性等因素可能有助于出现。然而，还需要对非人灵长类动物进行进一步的测试，才能将这些发现转化为人类的致病潜能。重要的是，现有疗法的失败定义了进一步研究和治疗发展的关键需求。有了这些知识，就可以生产出能够防止2b组特异性冠状病毒（如SHC014）出现的监测程序、诊断试剂和有效治疗方法，并且这些方法可以应用到维持相似异质池的其他冠状病毒分支。
除了针对未来出现的病毒提供准备外，这种方法还必须在美国政府强制暂停功能获得（GOF）研究的背景下加以考虑22。在先前的出苗模型（图4a，b）的基础上，SHC014-MA15等嵌合病毒的产生预计不会增加致病性。尽管SHC014-MA15相对于其亲代小鼠适应的SARS冠状病毒呈弱毒状态，但类似的研究表明，用MA15主干内的野生型城市尖峰病毒检测冠状病毒的致病性时，小鼠没有体重减轻，病毒复制减少23。因此，相对于Urbanispike–MA15 冠状病毒，SHC014-MA15显示了发病机制的增益（图1）。根据这些发现，科学审查小组可能认为基于循环菌株构建嵌合病毒的类似研究风险太大，无法进行，因为不能排除哺乳动物模型中致病性增加的情况。再加上对小鼠适应株的限制以及利用逃逸突变体开发单克隆抗体，对冠状病毒的出现和治疗效果的研究可能会受到严重限制。总之，这些数据和限制是GOF研究关注的一个十字路口；必须权衡准备和减轻未来疫情爆发的潜力与产生更危险病原体的风险。在制定向前发展的政策时，重要的是要考虑这些研究产生的数据的价值，以及这些类型的嵌合病毒研究是否值得进一步调查，而不是所涉及的固有风险。
总的来说，我们的方法已经使用了亚基因组学的数据来确定一个潜在的威胁，由像冠状病毒 SHC014这样的蝙蝠SARS造成的。由于嵌合体SHC014病毒能够在人气管培养物中复制，在体内引起发病机制并逃避当前的治疗方法，因此有必要对循环中的SARS样病毒进行监测并改进治疗方法。我们的方法还开放了使用亚基因组数据来预测病毒出现，并将此知识应用于准备治疗未来出现的病毒感染。
方法
病毒、细胞、体外感染和菌斑分析。
将野生型SARS-冠状病毒（Urbani）、小鼠适应型SARS-冠状病毒（MA15）和嵌合型SARS-like-冠状病毒培养于Vero E6细胞（取自美国陆军传染病医学研究所）和5%胎儿克隆血清（FCS）（Hyclone，South Logan，UT）以及抗生素/抗真菌药物（Gibco，Carlsbad，CA）。表达ACE2同源基因的DBT细胞（Baric实验室，来源未知）已经在人类和麝猫身上得到了描述；bat ACE2序列是基于来自莱舍诺提犀牛的序列，表达bat ACE2的DBT细胞已经建立，如前所述8。假分型实验类似于使用基于HIV的假病毒，如前所述10，并在表达ACE2同源基因的HeLa细胞（武汉病毒学研究所）上进行检测。如前所述，HeLa细胞生长在添加10%FCS（Gibco，CA）的最小必需培养基（MEM）（Gibco，CA）中。在Vero E6，DBT，Calu-32b4和原代人气管上皮细胞中的生长曲线如前所述。最近没有一个工作细胞株的库存被鉴定或检测支原体，尽管最初用于生产工作库存的种子库存没有受到污染。在北卡罗莱纳大学教堂山学院审查委员会批准的方案下获得了用于HAE培养的人肺。HAE培养物代表高分化的人气管上皮细胞，包括纤毛上皮细胞和非纤毛上皮细胞以及杯状细胞。如前所述，培养物在使用前在气液界面上培养数周。简单地说，用PBS洗涤细胞并接种病毒或在37℃下模拟稀释的PBS中40分钟。接种后，将细胞洗涤三次并添加新鲜培养基以表示时间“0”。在每个描述的时间点采集三个或更多的生物复制品。在任何样本收集中均未使用盲法，样本也未随机化。所有病毒培养均在生物安全级（BSL）3实验室进行，生物安全柜中有冗余风扇，如我们的第2组先前所述。所有人员都戴着电动空气净化呼吸器（呼吸方便，3M），带着Tyvek套装、围裙和靴子，戴着双手套。
序列聚类与结构建模。
从Genbank或Pathosystems资源整合中心（PATRIC）下载代表性冠状病毒的全长基因组序列和S1区氨基酸序列，通过使用100个引导或使用PHYML（HTTPS://CODE.GoGoLe.COM/P/YMLL/）包的最大似然估计分别与ClustalX和系统发育进行比较。使用PHYML包生成最大似然树。比例尺代表核苷酸替换。只有引导支持率高于70%的节点才被标记。结果表明，冠状病毒可分为αCoVs、βCoVs和γCoVs三个不同的系统发育类群。经典的亚群簇被标记为2a、2b、2c和2d（β-CoVs），1a和1b（α-CoVs）。利用Modeller（Max-Planck Institute bioinformicsToolkit）建立了SARS-RBD与ACE2复合物的结构模型，并基于晶体结构2AJF（Protein DataBank）建立了其SHC014和Rs3367的同源性模型。在MacPyMol（1.3版）中可视化和操作同源模型。
SARS样嵌合病毒的构建。
野生型和嵌合型病毒均来源于SARS-冠状病毒-Urbani或先前描述的相应小鼠适应型（SARS-冠状病毒-MA15）感染克隆（ic）。用限制性内切酶消化法提取SHC014的棘突序列质粒，连接到MA15感染性克隆的E和F质粒中。该克隆是从Bio-Basic设计和购买的，作为六个相邻的cdna，使用已发表的序列，两侧是独特的II类限制性内切酶位点（BglI）。随后，对含有野生型、嵌合SARS-冠状病毒和SHC014-冠状病毒基因片段的质粒进行扩增、切割、连接和纯化。然后进行体外转录反应合成全长基因组RNA，如前所述转染Vero E6细胞。从转染的细胞中提取培养基作为种子储备，用于后续实验。在这些研究中使用前，通过序列分析确认了嵌合病毒和全长病毒。北卡罗莱纳大学生物安全机构委员会和关注的两用研究委员会批准了嵌合体突变体和全长SHC014-冠状病毒的合成构建。
道德声明。
这项研究是根据美国国立卫生研究院实验动物福利办公室（OLAW）关于动物护理和使用的建议进行的。北卡罗来纳大学教堂山分校（北卡罗来纳州，许可证编号A-3410-01）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了这些研究中使用的动物研究方案（IACUC#13-033）。
小鼠和体内感染。
雌性、10周龄和12月龄BALB/cAnNHsD小鼠从哈兰实验室订购。小鼠感染如前所述。简单地说，动物被带进一个BSL3实验室，在感染前接受1周的驯化。对于感染和减毒活疫苗接种，用氯胺酮和二甲苯嗪的混合物麻醉小鼠，并在激发时用50μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）或稀释病毒对小鼠进行鼻内感染，每个感染组每次注射3或4只小鼠，如图图例所示。对于个别小鼠，感染标记，包括未能吸入全部剂量、从鼻子冒泡接种物或通过口腔感染，可能导致研究人员自行决定排除小鼠数据；感染后，未定义其他预先确定的排除或纳入标准。在任何动物实验中均未使用盲法，也未对动物进行随机分组。为进行疫苗接种，年轻和老年小鼠用20μl体积的0.2μg含明矾的SARS-冠状病毒双灭活疫苗或模拟PBS进行足垫注射；22天后用相同的方案增强小鼠，21天后激发小鼠。在整个实验期间，根据方案，对所有组的动物每天监测其疾病的临床症状（驼背、皮毛皱褶和活动减少）。前7天每天监测体重下降情况，此后，体重监测继续进行，直到动物恢复到初始体重或连续3天显示体重增加。所有体重下降超过其初始体重20%的小鼠均被地面喂养，只要低于20%的临界值，则每天进行多次进一步监测。如果小鼠的体重下降超过其初始体重的30%，则按照方案立即处死。任何被认为奄奄一息或不太可能康复的老鼠也被研究人员人道地牺牲。使用过量异氟醚实施安乐死，颈椎脱位证实死亡。所有的老鼠研究都是在北卡罗莱纳大学（动物福利保证A3410-01）进行的，使用的是北卡罗莱纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案。
组织学分析。
取左肺，在10%福尔马林缓冲液（Fisher）中浸泡1周，不充气。组织石蜡包埋，5μm切片由UNC-Lineberger综合癌症中心组织病理学核心设备制备。为了确定抗原染色的程度，使用市售的多克隆SARS-冠状病毒抗核衣壳抗体（Imgenex）对切片进行病毒抗原染色，并通过如上所述的气管和实质染色进行盲法评分20。图片是用奥林巴斯BX41显微镜和奥林巴斯DP71相机拍摄的。
病毒中和试验。
如前所述，用先前鉴定的抗SARS-冠状病毒抗体进行斑块减少中和效价测定。简言之，将中和抗体或血清连续稀释两倍，并与100株不同传染性克隆SARS-冠状病毒株的p.f.u.在37℃下孵育1h。然后将病毒和抗体加入带有5×105 Vero E6细胞/孔的6孔板中，并具有多个重复（n≥2）。在37℃孵育1小时后，在培养基中用3毫升0.8%琼脂糖覆盖细胞。平板在37℃孵育2d，中性红染色3h，计数斑块。斑块减少的百分比计算为（1-（有抗体的斑块数/无抗体的斑块数））×100。
统计分析。
所有实验均对两个实验组（两种病毒或接种疫苗和未接种疫苗的队列）进行对比。因此，病毒滴度和组织学评分的显著差异是通过双向跟踪t检验来确定的。数据在被比较的各组中呈正态分布，且具有相似的方差。
生物安全和生物安保。
报告的研究是在北卡罗莱纳大学生物安全机构委员会批准实验方案（项目名称：产生类似蝙蝠非典的冠状病毒的传染性克隆；实验室安全计划编号：20145741；附表G编号：12279）后开始的。这些研究是在美国政府审议过程研究基金暂停有关流感、MERS和SARS病毒的功能获得研究之前开始的（http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/Gainof Function.pdf）。这篇论文已经由美国国家卫生研究院（NIH）资助。要求继续进行这些研究，并已获得国家卫生研究所的批准。
SARS-冠状病毒是一种选择性的病原体。这些研究的所有工作都是按照批准的SARS冠状病毒、MERs冠状病毒和其他相关冠状病毒的标准操作程序（sop）和安全条件进行的。我们的机构冠状病毒 BSL3设施的设计符合微生物和生物医学实验室（BMBL）、美国卫生与公众服务部、公共卫生服务部、疾病控制中心（CDC）和国家卫生研究所（NIH）的生物安全建议的安全要求。实验室安全计划已提交给UNC环境健康与安全部（EHS）和CDC，并已批准使用。进入设施需要电子卡接入。所有工人都接受了环境、健康和安全方面的培训，以安全使用电动空气净化呼吸器（PAPR），并在BSL3设施中建立了适当的工作习惯和积极的医疗监督计划。我们的冠状病毒 BSL3设施包括冗余风扇、风扇应急电源、生物安全柜和冷冻柜，我们的设施可以容纳SealSafe鼠标架。分类为BSL3的材料包括SARS-冠状病毒、bat-冠状病毒前体菌株、MERS-冠状病毒和从这些病原体衍生的突变体。在BSL3设施内，在经认证的二级生物安全柜（BSC）中进行感染性病毒试验。所有工作人员都穿着工作服、泰威克西装和围裙、便签和鞋套，双手戴双手套。疯牛病三级使用者须接受由大学雇员职业健康诊所（UEOHC）监督的医疗监督计划，该计划包括每年一次的身体接种、每年一次的流感疫苗接种，以及在疯牛病三级工作期间与冠状病毒感染有关的任何症状的强制性报告。所有的BSL3用户都接受了暴露管理和报告协议的培训，准备好自我隔离，并接受了在紧急情况下安全运送到当地传染病管理部门的培训。所有潜在的暴露事件都由环境健康安全部和环境与职业健康安全部报告和调查，并向疾病预防控制中心和国家卫生研究所提交报告。
附加代码
附属物
蛋白质数据库
2AJF公司
修正历史
2015年11月20日，在本文最初在线发布的版本中，作者忽略了向Z.-L.S.确认资金来源USAID-EPT-PREDICT funding from EcoHealth Alliance。本文的印刷版、PDF版和HTML版已更正此错误。
参考资料
略。
致谢
这份手稿的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家变态反应与传染病研究所和国家老龄研究所（NIH）的资助，获得了U19AI109761（R.S.B.）、U19AI107810（R.S.B.）、AI085524（W.A.M.）、F32AI102561（V.D.M.）和K99AG049092（V.D.M.），中国国家自然科学基金会（National Natural Science Foundation of China）颁发了81290341（Z.-L.S.）和31470260（X.-Y.G.），美国国际开发署（USAID-EPT）还预测了来自生态健康联盟（Z.-L.S.）的资助。人类气管上皮细胞培养由NIH国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助，NIH授予其DK065988（S.H.R.）。我们还感谢M.T.Ferris（北卡罗莱纳大学遗传学系）对统计方法的审查和C.T.Tseng（德克萨斯大学医学部微生物学和免疫学系）提供的Calu-3细胞。在GOF研究基金暂停之前，启动并执行了全长和嵌合体SHC014重组病毒的实验，并已由NIH审查和批准继续研究。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
作者信息
隶属关系
美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学流行病学系
维内特·德梅纳赫里，博伊德·兰特，卡丽·德宾克，丽莎·格拉林斯基，杰西卡·普兰特，瑞秋·格雷厄姆，特雷弗·斯科比，埃里克·F·唐纳森和拉尔夫·S·巴里克
美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学微生物学和免疫学系
Kari Debbink和Ralph SBaric
国家毒理学研究中心，食品和药物管理局，杰佛逊，阿肯色，美国
苏达卡尔阿涅霍特拉姆
中国科学院武汉病毒学研究所特殊病原体与生物安全重点实验室
兴义·戈和正丽·石
美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学细胞生物学和生理学系
斯科特·H·兰德尔
美国北卡罗莱纳州教堂山北卡罗莱纳大学Marsico肺研究所囊性纤维化中心
斯科特·H·兰德尔
瑞士苏黎世贝林佐纳微生物研究所生物医学研究所
安东尼奥·兰扎韦基亚
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院达纳法伯癌症研究所癌症免疫学与艾滋病系
韦恩·马拉斯科
美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学部
韦恩·马拉斯科
贡献
V. D.M.设计、协调和执行实验，完成分析并撰写手稿。B. L.Y.设计感染性克隆并回收嵌合病毒；S.A.完成中和试验；L.E.G.帮助进行小鼠试验；T.S.和J.A.P.完成小鼠试验和菌斑试验；X.-Y.G.进行假分型试验；K.D.生成结构图和预测；E.F.D.生成系统发育分析；R、 L.G.完成RNA分析；S.H.R.提供原代HAE培养物；A.L.和W.A.M.提供关键单克隆抗体试剂；Z.-L.S.提供SHC014棘突序列和质粒。R、 S.B.设计实验并撰写手稿。
通讯作者
与维内特·德梅纳赫里或拉尔夫·巴里克的通信。
道德宣言
相互竞争的利益
作者声明没有相互竞争的经济利益。
补充资料
补充文字和数字
补充图1-6和补充表1-4（PDF 4747 kb）
权利和权限
重印和许可
关于这篇文章
通过交叉标记验证货币和真实性
引用这篇文章
Menachery，V.，Yount，B.，Debbink，K.等人。一个类似SARS的蝙蝠冠状病毒群显示了人类出现的可能性。Nat医学211508-1513（2015年）。网址：https://doi.org/10.1038/nm.3985
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2015年6月12日收到
接受日期：2015年10月8日
2015年11月9日发布
发行日期：2015年12月
DOI https://doi.org/10.1038/nm.3985
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